Возможность применения ПЦР в ветеринарии


подписаться на рассылку анонсов статей:
 
 
поиск по разделу «Статьи»

всего статей: 1513


Возможность применения ПЦР в ветеринарии



Инфекционная патология в ветери­нарии охватывает широкий круг бо­лезней, различных как по характе­ру течения (острые, хронические, латентные), степени распростране­ния (от спорадических случаев до эпизоотии), так и по сложности их диагностики. Важное, а при некото­рых болезнях решающее значение имеют серологические исследова­ния, направленные на выявление антител, вырабатываемых организ­мом животного в ответ на внедре­ние инфекционного агента или вак­цины. Несмотря на ряд достоинств, методы, основанные на этом прин­ципе, обладают недостаточной чувствительностью и специфич­ностью. Существенный прорыв был сделан в последние годы, когда для диагностических целей привлекли методы генной инженерии и био­технологии. Для диагностики ин­фекционных заболеваний наиболь­шее применение нашёл способ амплификации (умножения) нукле­иновых кислот: полимеразная цеп­ная реакция (ПЦР), лигазная цепная реакция, NASBA-метод и др. Актив­ное развитие и внедрение метода ПЦР в диагностическую практику позволило продемонстрировать ос­новные достоинства и эффектив­ность этой реакции, обнаружить не­достатки и выработать подходы для их преодоления.

ПЦР в лабораторной диагностике инфекций характеризуется быстро­той, непревзойдённой чувствитель­ностью и высокой специфич­ностью, что позволяет обнаружи­вать микроорганизмы, присутству­ющие в очень низких концентраци­ях (1-10 возбудителей в пробе). При этом ДНК инфекционных аген­тов может быть достаточно эффек­тивно экстрагирована из любой биологической жидкости или тка­ни, а также из проб объектов окру­жающей среды (почвы, воды и т.д.) и продуктов питания. Полимераз­ная цепная реакция эффективна при обнаружении бактериальных, грибковых, паразитарных и вирус­ных патогенов.

Одним словом, это метод, осно­ванный на принципе амплифика­ции, — изолированного умножения гена или его определённого фраг­мента. Амплификация — один из способов выживания микроорга­низмов и клеток животных в усло­виях действия противоопухолевых и противобактериальных препара­тов. ПЦР позволяет проводить ана­логичный процесс in vitro, то есть в пробирке.

Основные положения амплифи­кации ДНК in vitro были обосно­ваны сотрудником корпорации «Cetus» (США) Кэрри Маллисом в 1983 году. Через 10 лет за эту раз­работку он был удостоен Нобелев­ской премии по химии.

Метод базируется на достройке ферментом (термостабильная ДНК-полимераза) олигонуклеотидных затравок (праймеров), присоеди­нённых к денатурированной низкокопийной ДНК-матрице. Праймеры определяют специфичность реак­ции и величину фрагмента. Про­цесс амплификации включает мно­гократное повторение определён­ных циклов, как правило, 30-40. Каждый состоит из трёх основных стадий: денатурации ДНК, отжига (присоединения) и достройки прай­меров.

На первой стадии двухцепочечная ДНК-матрица денатурируется при 94° С с образованием одноцепочечных ДНК. На второй темпе­ратура понижается до 55-65° С и происходит присоединение прай­меров к каждой из двух одноцепо-чечных ДНК. На третьей фермент (термостабильная ДНК-полимераза) при температуре 72° С достраивает оба праймера в направлении от 3-го к 5-му концу, в результате чего образуется двуцепочечная ДНК.

После первого цикла создаются длинные фрагменты, так как поли­мераза достраивает праймеры, ис­пользуя в качестве матрицы весь ге­ном. В следующих циклах праймеры отжигаются с вновь синтезиро­ванными молекулами ДНК. Полиме­раза останавливается, доходя до конца этих молекул, то есть до прай­меров, использованных в предыду­щем цикле. После каждого цикла число молекул матрицы удваивает­ся, в результате происходит экспо­ненциальная амплификация фраг­мента ДНК-матрицы. Это позволяет за 25-40 циклов накопить ПЦР-продукт в достаточном количестве для визуальной детекции после электрофоретического разделения и ок­рашивания бромистым этидием.

Основные компоненты ПЦР

1.       Два синтетических олигонукле­отидных праймера (длиной пример­но по 18-25 нуклеотидов). Каждый из них комплементарен одной из цепей двуцепочной матрицы, огра­ничивающей начало и конец амплифицируемого участка. Специфич­ность реакции в основном опреде­ляется температурой отжига прай­меров, при которой происходит их комплементарное взаимодействие с ДНК-матрицей. Температура зави­сит от длины праймера и содержа­ния G-C пар (С — гуанин, С — цитозин). Как правило, она варьируется в диапазоне 50-64° С. Дизайн прай­меров осуществляется с использо­ванием специальных компьютер­ных программ и автоматических ДНК-синтезаторов.

2.   Термостабильная ДНК-полиме­раза— фермент, который катализи­рует реакцию полимеризации ДНК. Полимераза для использования в ПЦР должна сохранять активность при высокой температуре длитель­ное время, поэтому используют ферменты, выделенные из термо­филов — Thermus aquaticus (Taq-полимераза), Pyrococcus furiosus (Pfu-полимераза), Pyrococcus woe-sei (Pwo-полимераза) и другие.

3.       Дезоксинуклеотидтрифосфаты (dATP, dGTP,   dCTPdTTP).

4.   Ионы Mg2+, необходимые для активации полимеразы.

5.   Буфер, создающий оптималь­ные условия для функционирования фермента. Как правило, ис­пользуется Трис-HCI буфер, кото­рый удерживает рН реакционной среды в пределах 7,8. Для стабили­зации фермента в среду добавляют желатин или бычий сывороточный альбумин, неионные детергенты (Твин-20, Тритон Х-100 и др.).

Наработка ампликонов заданной длины начинается с 3 до 25 циклов и носит экспоненциальный харак­тер. В силу истощения дезоксинуклеотидтрифосфатов, праймеров, инактиваций Taq-полимеразы, воз­растания конкуренции ампликонов в ферменте, начиная с 40-45 цик­лов реакция выходит на плато. От­сюда, как правило, при постановке реакции число циклов не превыша­ет 30-35.

ПЦР проводят в амплификаторе — приборе, обеспечивающем перио­дическое охлаждение и нагревание пробирок, обычно с точностью не менее 0,1° С. Обычно в нём можно задавать сложные программы, в том числе возможность «горячего стар­та» (Touchdown ПЦР) и последующее хранение амплифицированных мо­лекул при 4° С. Для реакции в ре­альном времени выпускают прибо­ры, оборудованные флуоресцент­ным детектором. Из поставляемых зарубежными фирмами наиболее популярны амплификаторы фирм «Перкин-Эльмер», «Эппендорф» и «Хайбенд».

В настоящее время разработаны отечественные приборы: «Цикло-темп», «Медимакс», «Термоцик», «Амрly 4L» и др.

Проведение полимеразной цепной реакции

Она состоит из трёх основных процедур: пробоподготовки, кото­рая в основном сводится к выделе­нию ДНК или РНК, постановки ПЦР и детекции амплифицированного продукта.

Выделение нуклеиновых кис­лот (ДНК, РНК). Исследуемым ма­териалом для ПЦР могут служить лю­бые, даже гистологические препара­ты. Определение можно проводить, используя как клинический и патологоанатомический материал, так и пробы с объектов внешней среды.

В зависимости от вида определяе­мого возбудителя и клинической пробы применяют различные спо­собы выделения ДНК (РНК). В неко­торых случаях обработка заключа­ется в добавлении лизирующего агента, содержащего раствор гуа-нидинтиоционата, с последующей сорбцией ДНК (РНК), многократной отмывки и элюции, очищенной нук­леиновой кислоты.

В других случаях необходима депротеинизация фенолом/хлоро­формом с последующим осажде­нием ДНК (РНК) этанолом или изопропанолом. В последние годы ряд отечественных фирм («Литех», «ДНК-технология», «Диалат» и др.) производят наборы для экстракции ДНК и РНК из различных клиничес­ких образцов.

Постановка ПЦР. В пробирку ти­па «Eppendorf» объёмом 0,2 или 0,5 мл добавляют определённое коли­чество реакционной смеси, состоя­щей из воды, ПЦР-буфера, раствора дизоксинуклеотидтрифосфатов, раствора праймеров и Taq-полиме­разы. Затем вводят одну каплю ми­нерального масла с высокой точкой кипения, например вазелинового, для предотвращения испарения реакционной смеси в процессе амплификации. Если использовать амплификатор с подогревающейся крышкой, этого делать не требуется.

Добавление пирофосфатазы мо­жет увеличить выход ПЦР-реакции. Этот фермент катализирует гидро­лиз пирофосфата, побочного про­дукта присоединения нуклеотидтрифосфатов к растущей цепи ДНК, до ортофосфата.

Обработанную клиническую про­бу вносят под масло в объёме 5-10 мкл. Амплификация проводится в программируемом термостате (амп­лификаторе) в автоматическом ре­жиме по программе, соответствую­щей виду определяемой инфек­ции. Как правило, необходимо 1,5-3 часа в зависимости от задан­ной программы.

При постановке реакции прово­дится соответствующий контроль: положительный — препарата ДНК исследуемого возбудителя; отрица­тельный — деионизированной во­ды. Последний необходим для про­верки реакционной смеси на нали­чие контаминации продуктами амп­лификации (ампликонами).

В одной реакции амплификации возможно определение нескольких инфекций (Multiplex PCR). С этой целью в реакционную смесь добав­ляют несколько пар праймеров, од­нако при этом уменьшается количе­ство воды. Учитывая, что чувстви­тельность реакции снижается про­порционально разбавлению, реко­мендуется одновременно опреде­лять не более 3 инфекций.

Для определения РНК-содержащих вирусов в составе реакцион­ной смеси дополнительно вносят обратную транскриптазу и ингиби­тор рибонуклеаз (RT-PCR).

Эффективность ПЦР зависит от многих факторов, в частности от ко­личества ДНК-матрицы, качества Taq-полимеразы и дезоксинуклеотидтрифосфатов, специфичности праймеров, концентрации Мд2+ и программы амплификации. Для по­лучения максимального эффекта проводят оптимизацию реакции. В таблице приведены пределы вариа­ции её основных параметров.

Чувствительность ПЦР существен­но зависит от температуры отжига праймеров. При заниженной повы­шается вероятность амплификации неспецифических фрагментов, при повышенной снижается выход амп­лифицированного продукта, так как праймеры слабо взаимодей­ствуют с ДНК-матрицей.

Параметр

Диапазон вариаций

Градиент вариаций

Концентрация Mg2+,

1,5-3,0 mM

0,25 mM

Количество Taq-полиме­разы в пробирке

0,5-3,0 ед.

0,5 ед./100 мкл

Концентрация каждого праймера

0,2-2,0 мкМ

0,5 мкМ

Температура отжига

45-64° С

2-3° С

    В настоящее время разработан ряд подходов, повышающих специ­фичность реакций. Часто с этой целью применяется так называемая «Nested PCR» (гнездовая ПЦР). Принцип данного метода заключа­ется в использовании двух пар праймеров, одна из которых способна амплифицировать внутрен­ний участок ампликона, полученно­го после первого раунда, с внеш­ней парой праймеров. Применение гнездовой ПЦР имеет преимущест­ва: высокая чувствительность мето­дики; отсутствие необходимости ис­пользовать другие методы. К недос­таткам относят перенос продуктов реакции из одной пробирки в дру­гую, что существенно снижает кон­центрацию ингибиторов, а также приводит к появлению большого количества ложноположительных результатов вследствие перекрёст­ной контаминации проб продукта­ми амплификации.

В последние годы для повышения чувствительности и специфичности реакции используется «горячий старт». Суть его заключается в том, что прежде чем добавлять Taq-no-лимеразу, реакционная смесь про­гревается предварительно до 95° С. Это исключает возможность образо­вания неспецифических фрагмен­тов вследствие неспецифического отжига праймеров при температуре ниже оптимальной.

Механизм простой полимеразной цепной реакции непригоден для идентификации рибонуклеи­новых кислот (РНК), так как Taq-no-лимераза неспособна катализиро­вать синтез ДНК на матрице РНК. Вместе с тем хорошо известно, что геномы многих вирусов состоят из молекул рибонуклеиновых кис­лот (РНК), и вследствие этого акту­альна идентификация РНК-виру­сов. Практически это решается с помощью нескольких приёмов, в частности использования дополни­тельного фермента — РНК-зависи­мой ДНК-полимеразы — обратной транскриптазы (RTreverse tran­scriptase). Реакция, катализируе­мая этим ферментом, приводит к образованию однонитевых фраг­ментов ДНК, используемых в даль­нейшем в амплификации с по­мощью Taq-полимеразы.

Как было отмечено выше, Taq-пoлимераза неспособна катализиро­вать процесс обратной транскрип­ции, то есть синтез однонитевой ДНК на РНК-матрице. В 1991 году Маерсом  и  Гельфандом  охарактеризован фермент ДНК-зависимой ДНК-полимеразы, выделенной из другого экстремального термофила Thermus thermophilus (Tth-полиме-раза), который в присутствии ионов магния и хелаторов ионов марган­ца позволял ферменту катализиро­вать обычную ДНК-зависимую ДНК-полимеразную реакцию. Этот фер­мент мог быть использован для од­новременного синтеза комплимен­тарных однонитевых фрагментов ДНК и амплификации.

Регистрация результатов. В большинстве случаев амплифицированный фрагмент ДНК или кДНК выявляют методом электрофореза в 1,5-2% геля агарозы в присут­ствии бромистого этидия, который образует с фрагментами ДНК устой­чивый комплекс. При облучении ге­ля ультрафиолетом длиной волны 290-330 нм амплифицированные фрагменты ДНК проявляются в ви­де светящихся полос.

Специфичность полосы опреде­ляется её положением по отноше­нию к ДНК-маркерам и положи­тельному контролю.

Специфичность амплифицированного фрагмента также может быть подтверждена рестрикционным анализом или гибридизацией со специфическим меченым флуо­ресцентным или радиоактивным зондом.

Другие методы детекции основа­ны на идентификации меченых компонентов реакции. В частности, в отдельных тест-системах (фирмы «Хофманн Ля Рош») используются праймеры, меченные биотином. В процессе детекции амликон, ме­ченный биотином, гибридизуется со специфическим ДНК-зондом, иммобилизованным на микроп­ланшете. На следующей стадии биотин связывается с конъюгатом авидин-пероксидаза хрена. Актив­ность фермента, входящего в комп­лекс ампликон-биотин-авидин-пероксидаза хрена, выявляют приё­мом, используемым при стандарт­ном иммуноферментном анализе. Интенсивность окраски определя­ют на планшетном фотометре при 450 нм. Данный подход позволяет проводить объективную оценку результатов реакции в виде показате­лей оптической плотности и, следо­вательно, количественно опреде­лять концентрацию ДНК или РНК в пробе.

Существуют и другие варианты де­текции ПЦР-продукта. Успешно ис­пользуются зонды, меченные дитоксигенином или флуоресцеином. Для выявления комплекса ампликон-дитоксигенин (флуоресцеин) применяют меченные пероксидазой хрена моноклональные антитела к дитоксигенину или флуоресцеину.

W. D. Harrman, M. Wall (1995 г.) предложили для количественной оценки продуктов реакции исполь­зовать миниатюрную видеокамеру, передающую информацию с гельэлектрофореграммы на экран мо­нитора, что позволяет сравнить ин­тенсивность окраски ДНК-стандарта и амплифицированного фрагмента.

Полимеразная цепная реакция — высокочувствительный специфич­ный метод. К сожалению, он не исключает возможной контамина­ции.

Попадание в реакционную про­бирку следовых количеств ДНК или кДНК возбудителя (специфических продуктов амплификации; ДНК-стандарта, используемого в качест­ве положительного контроля; ДНК или кДНК возбудителя клиническо­го образца) приводит к амплифика­ции в процессе реакции специфи­ческого фрагмента ДНК и, как след­ствие, к появлению ложноположи­тельных результатов.

Опасность представляют в основ­ном два вида контаминации: пере­крёстная — от пробы к пробе (в процессе обработки клинических образцов или разбрызгивания ре­акционной смеси), что приводит к появлению спорадических ложноположительных результатов; и про­дуктами амплификации (ампликоны), которые являются также при­чиной получения ложноположи­тельных результатов. В процессе проведения ПЦР ампликоны накап­ливаются в больших количествах и являются классическими матрица­ми для реамплификации.

Различают и контаминацию сле­довыми ампликонами посуды, автоматических пипеток и лаборатор­ного оборудования, поверхности лабораторных столов.

На основании опыта ПЦР-лабораторий к настоящему времени сфор­мулированы   основные   принципы   организации   диагностики,   исключающие   возможность   контаминации   и   получения   ложноположительных результатов.

               Необходимо   разделить   различные  стадии   проведения   анализа, размещая их в отдельных помещениях: для выделения ДНК или РНК; для проведения детекции продуктов амплификации.

Клинические образцы необходимо помещать только в одноразовые стерильные пластиковые пробирки. Работа должна производиться в лабораторной одежде, сменяемой при переходе из одного помеще­ния в другое. Желательно, чтобы на каждом этапе проведения реакции работали другие сотрудники.

На различных стадиях анализа следует иметь отдельные наборы полуавтоматических пипеток.

Использовать только одноразо­вые материалы, наконечники для микропипеток, пробирки, перчатки и т.д. Желательно применять нако­нечники с аэрозольным фильтром, предохраняющим попадание мик­рокапель раствора в пипетку. Пос­ле работы пробирки и наконечники должны сбрасываться в дезинфи­цирующий раствор (1Н соляной кислоты, 10% гипохлорида натрия, 10% хлорной извести).

Облучение рабочих поверхностей проводят в течение 1 часа до нача­ла и после опыта (излучение до 260 нм).

Неуклонно выполняя эти требова­ния и применяя при постановке ПЦР отрицательный контроль нук­леиновых кислот, буферного раст­вора, праймеров, можно практи­чески исключить ложноположительные результаты.

Кроме организационных мер, в настоящее время успешно приме­няют метод ферментативного пре­дупреждения контаминации. Суть его заключается в том, что вместо одного из 4 дНТФ, а именно вместо дТТФ  (дезокситимидин-трифосфат) вводится аналог дУТФ (дезоксиуридин-трифосфат), который включив­шись в амплификон вместо дТТФ, делает этот амплификон чувстви­тельным к ферменту урацил-гликозилазе, которая также вводится в амплификационную смесь. Некото­рые коммерческие ПЦР-тест-систеы содержат эти компоненты и по­этому гарантируют отсутствие ложноположительных результатов от контаминации. Подобную систему защиты имеют ряд тест-систем, вы­пускаемых зарубежными фирма­ми, в частности фирмой «Хофманн Ля Рош».

В качестве химического способа для предупреждения ложноположительных результатов от контами­нации амплификонами используют псорален-соединение, легко пов­реждающее их ультрафиолетовыми лучами.

Для контроля ингибирования ПЦР продуктами, содержащимися в клинической пробе, вводят внут­ренний контроль: в состав ПЦР-смеси вносят ДНК-матрицу, которая амплифицируется одновременно с ДНК клинической пробы в одной и той же пробирке.

Амплифицированная ДНК-матри­ца контроля свидетельствует об от­сутствии ингибирования реакции. В России подобные наборы поставля­ет фирмы «Литех» (Москва), за ру­бежом — «Хофманн Ля Рош».

Достоинства и преимущества ПЦР-диагностики инфекцион­ных заболеваний

Метод прямой и позволяет дос­тичь предельно возможной чувстви­тельности: от одного до нескольких возбудителей в пробе. Специфич­ность метода составляет 99-100 процентов. Для ПЦР-анализа приго­ден любой материал, в том числе и гистологические препараты. Коли­чество исследуемого материала, как правило, составляет несколько десятков микролитов. Высокая чувствительность метода позволяет контролировать эффективность проводимого лечения. ПЦР успеш­но используется при диагностике труднокультивируемых и некультивируемых   возбудителей,   а  также хронических, латентных и персистентных форм инфекции. Длитель­ность анализа не превышает 5-6 часов.

Но наряду с достоинствами име­ется определённый недостаток, ко­торый можно охарактеризовать как технологический. Подразумеваются повышенные требования к оснаще­нию лаборатории, качеству тест-на­боров и строжайшее соблюдение регламента исследования во избе­жание получения ложных результа­тов. Решение проблемы качества анализов возможно при соответ­ствующей квалификации персона­ла и обязательной сертификации лаборатории.

Разработка методик и испытание приборов и оборудования — один из этапов большой работы по внед­рению ПЦР-методов в практику ди­агностических лабораторий. В связи с возрастающим интересом к ПЦР-диагностике внедрение её методов в систему государственной ветери­нарной службы — дело сегодняш­него дня. Необходимо отметить, что перспективными направлениями являются определение антибиотикорезистентности клинических штаммов возбудителей, возмож­ность количественного учёта ре­зультатов для контроля динамики инфекционного процесса, правиль­ного выбора тактики лечения и оценки эффективности применяе­мых лекарственных средств.

К настоящему времени ветери­нарными специалистами уже раз­работаны тест-системы для диагнос­тики методом ПЦР таких заболева­ний, как туберкулёз, сибирская яз­ва, лейкоз, чума крупного рогатого скота, бешенство, ящур, бруцеллез, кампилобактериоз, листериоз, хламидиоз животных, классическая чу­ма свиней, респираторно-репродуктивный синдром свиней, парвовирусная инфекция свиней, энцефаломиокардит свиней, сальмонеллёз, стафилококкоз, микоплазмоз, болезнь Марека, реовирусная инфекция, болезнь Гамборо, ин­фекционный бронхит птиц, ньюкаслская болезнь; чума плотоядных, вирусный энтерит норок, вирусный гепатит утят и др.

Диагностика частной патоло­гии методом ПЦР. В данном раз­деле рассмотрены только некото­рые виды патологии, при которых этот метод играет важную роль. Следует отметить, что данная диаг­ностика — один из способов и не может полностью заменить приме­няемый в настоящее время комп­лекс диагностических исследова­ний.

Среди методов лабораторной ди­агностики гриппа птиц наиболее эффективным считается метод полимеразной цепной реакции. Исполь­зуя праймеры к НА, NA и М-генам различных субтипов вируса гриппа, Zhang W. и Evans D.N. (1991 г.) впер­вые продемонстрировали возмож­ность детекции вирусов. Однако ис­следования были выполнены на музейных штаммах.

Главными преимуществами ПЦР в сравнении с методами культурального подхода являются его более высокая чувствительность, быстрота и безопасность для пер­сонала. При сравнении с сероло­гическими методами ПЦР сущест­венно выигрывает, поскольку поз­воляет выявлять вирусы гриппа на самых ранних стадиях, задолго до появления антител.

Кроме явных диагностических преимуществ, его дополняют мето­дом секвенирования ДНК, и тогда он является универсальным молекулярно-генетическим подходом к определению большинства биоло­гических свойств вирусов грип­па птиц, позволяющим выявлять родство циркулирующих штаммов, предсказывать его опасность для человека и эффективность проти­вовирусной терапии.

Хламидиозная инфекция ши­роко распространена практически среди всех видов млекопитающих и наносит существенный экономи­ческий ущерб различным отраслям животноводства, вызывая гибель животных, патологию их воспроиз­водительных органов, аборты, рож­дение мёртвого или нежизнеспо­собного приплода.

Больные животные часто стано­вятся источником инфекции работ­ников хозяйств, что приводит к возникновению эпидемических вспы­шек. Распространённость возбуди­телей хламидиозов в природе сре­ди диких животных и особенно птиц представляет постоянную уг­розу спорадических заболеваний для людей, профессионально не занятых в сельском хозяйстве.

Длительное время общепризнан­ным эталоном для прямых мето­дов выявления хламидий считает­ся выделение возбудителя в куль­туре клеток. Однако метод имеет недостатки, существенно затруд­няющие его широкое использова­ние в практической ветеринарии. Прежде всего высокий риск инфи­цирования персонала, а следова­тельно, необходимость проведе­ния работ по выделению возбуди­теля в специальной режимной ла­боратории.

Кроме того, культуральный метод трудоёмок и занимает много време­ни. Несмотря на то, что для высева патогена подходит практически лю­бой материал от инфицированного животного, успех исследования во многом зависит от скорости транс­портировки проб в лабораторию и соблюдения условий доставки об­разцов (специальные транспортные среды, охлаждение, добавление антибиотиков, предварительная очистка материала от токсичных ве­ществ и т.д.).

С учётом этих недостатков были разработаны альтернативные тесты, такие, как определение антиге­на методами иммуноферментного анализа (ИФА), прямой иммунофлуоресценции (МФА), а также экспресс-методами.

Вместе с тем для ИФА-детекции антигенов так же, как и для культурального метода, характерны низ­кая чувствительность и специфич­ность. Учитывая, что при проведе­нии метода иммунофлуоресценции для достоверного выявления хла­мидий необходимо обнаружить оп­ределённое число элементарных телец во всём исследуемом образ­це, чувствительность анализа зави­сит от опыта работы лаборанта.

В настоящее время одним из наи­более перспективных следует счи­тать  метод  полимеразной   цепной реакции (ПЦР). Для диагностики хламидиозов человека и животных он был впервые применён в 1989 году. Это быстрый и надёжный ди­агноз, своевременная эффективная терапия и научно обоснованная профилактика. Дополнительная ин­формация о разновидности возбу­дителя, легко получаемая методом ПЦР, позволит проводить эпидеми­ологический контроль и предотвра­щать распространение опасных штаммов хламидий.

Сегодня основным массовым и доступным в ветеринарной практи­ке методом прижизненной диаг­ностики туберкулёза является внутрикожная туберкулиновая про­ба с применением ППД-туберкулина для млекопитающих. Однако данный тест имеет известные недос­татки: длительный срок выявления заболевания; возбудитель туберку­лёза при посеве патолого-анатомического материала растёт медлен­но; колонии микобактерий туберку­лёза бычьего вида появляются толь­ко через 20-60 дней, а птичьего — через 15-30 дней посева. При адап­тации к питательной среде скорость роста может возрастать.

При диагностике туберкулёза ПЦР-метод применяют в случае по­лучения положительных результа­тов при проведении плановых ал­лергических исследований в благо­получных по туберкулёзу хозяй­ствах. Кровь всех животных анали­зируют при введении туберкулина. Также полимеразную цепную реак­цию целесообразно применять при изучении патматериала от убитых животных для диагностики и иден­тификации культур М. Bovis и М. Tuberculosis с другими видами ми­кобактерий.

В заключение следует отметить, результаты ПЦР-анализа, как и дру­гие диагностические тесты in vitro, необходимо рассматривать с учё­том данных, полученных традици­онными методами.

Для рационального использова­ния ПЦР в клинической практике нужно определить её место, учиты­вая специфику поставленных задач и экономическое обоснование для решения тех или иных проблем.

Статья былп опубликована в журнале "Птицеводство", 2009 г.







 

администрация сайта: ООО «Фаулер»
ждем ваших писем: deneb@webpticeprom.ru

 
птицеводство
Webpticeprom птицеводство
  1. Главная
  2. Статьи про птицеводство
  3. Болезни и лечение птиц
  4. › Возможность применения ПЦР в ветеринарии
 
Болезни и лечение птиц
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
на сайте страниц: 12850